你准备好转移你的蛋白了吗?湿转移与半干转移


Neha G 发布于 2018 年 4 月 18 日 03:15:00

18_WBL_120_WB_Wet_v_Dry_blog_1600X800_v3

 你很兴奋地进行一次蛋白印迹实验来检测“你最喜欢的蛋白”。裂解物已制备好,并且已通过 SDS-PAGE 分离出蛋白。现在,是时候将蛋白从凝胶转移到膜上了,你坐下来想 — 用湿转移,还是半干转移呢??或者,作为一名研究生,你比我那时候准备得更好,并且你已经知道了你的下一个步骤,在这种情况下,你很清楚湿转移和半干转移的优缺点。

根据常规实验室知识,湿转移(水槽)方法能更好地从凝胶上转移成为印迹,但半干技术则更快,消耗的缓冲液也少得多,更别说它还是一个干净的流程了,这很适合我们中比较挑剔的人。膜要干燥,因此湿转移不太容易失败,尤其建议用于大蛋白。在半干转移中,夹心结构直接放在正电极和负电极之间。在湿转移中,夹心结构放在正电极和负电极之间,并浸泡在应用了电场的转移缓冲液中。

半干转移: 纸 > 凝胶 > 膜 > 纸(均用转移缓冲液浸湿)

湿转移: 海绵 > 纸 > 凝胶 > 膜 > 纸 > 海绵

把较大的蛋白从凝胶转移到膜的速度较慢,因此你可以根据你的目的蛋白大小来考虑延长转移时间。如果这样做,我们建议用转移缓冲液将甲醇的浓度降低至 5-10%。 

在很大程度上,决定使用湿转移还是半干转移与使用的膜的类型有关。虽然许多人认为硝化纤维和 PVDF 可以在很大程度上互换,但需要记住仍然存在一些差异。PVDF 通过疏水相互作用结合蛋白,而硝化纤维则同时通过疏水和静电相互作用结合蛋白。孔径是影响转移条件的另外一个重要因素,两种膜都可用于各种孔径来满足用户需求。一些厂家建议,在封闭前先将膜风干,然后用甲醇再次浸湿,以增强与转移蛋白的结合,并降低背景。这个脱水步骤可以去除变性蛋白与膜之间的水分。如有必要,在特殊和困难情况下需要用多聚甲醛(Preterre 等)固定膜,以提高蛋白存留率。 

因此,对于必须要求绝对最高转移水平的人来说,湿转移到硝化纤维上可能是最好的办法。但就速度和易用性而言,半干转移通常更能接近一般用途标准,即使在进行一些微调后。对于我们多数人来说,归根结底是我们实验室的哪台装置可以用,以及优化主要目的蛋白的转移条件。

好了,希望在你凝神斟酌是使用湿转移还是半干转移时,你的蛋白没有从凝胶上流出!

有兴趣了解更多有关蛋白印迹实验的信息?

点击此处

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

订阅电子邮件

点击此处

最新文章

Powered by Translations.com GlobalLink OneLink SoftwarePowered By OneLink