从显微镜爱好者角度看组织透明化


Ginny B. 发布于 2019 年 10 月 30 日 03:00:00

就实验的复杂性和数据集的丰富性而言,生物成像数据具有巨大的潜力。早期的成像实验大多是描述性的,显示“目标 X 是否存在于目标细胞中”;现代实验可大规模多路复用、定义复杂的空间关系,测量微小亚细胞成分的水平或数量,甚至测量 mRNA。

研究人员采用了许多方法来生成更大、更复杂的数据集。一些小组正在尝试通过使用 CyCIF1 或 MIBI 质谱流式2和来自 Fluidigm (CyTOF)、Nanostring (GeoMx) 和 Neogenomics (MultiOmyx) 高度复杂的商业产品查看数十种(或数百种!)蛋白质来增进对系统生物学的理解。其他人则采用机器学习方法来量化和定义细胞群和空间关系,这些方法包括组织成像3、成像流式4和数字病理5

还有其他人正在使用诸如 CLARITY6之类的组织透明化技术在器官水平观察蛋白质染色。无论使用哪种平台,这些技术均可以获得比以往更多的图像数据。有这么多种选择,何时应该考虑进行组织透明化实验?当您想在宏观层面研究精细细节时,此技术最合适。

 

 

CLARITY 发明人 Kwanghun Chung 实验室最近制作的一段透明化的小鼠大脑的精美视频显示了 GFAP 阳性星形胶质细胞和 NeuN 阳性成熟神经元及其在整个大脑中的位置关系。该技术不仅可以产生视觉上令人惊叹的效果图,它还是神经科学家在大规模分析中研究精细细节的有用工具。大脑是一个特别复杂的结构,其中了解整个器官和局部细节可以为研究人员提供有用的信息。

尽管大脑中神经元的数量相对固定,但星形胶质细胞却是不断变化的细胞群。在疾病的背景下,观察神经元与星形胶质细胞之间的关系非常有用7。GFAP 是星形胶质细胞独有的结构蛋白8。除了星形胶质细胞在健康的中枢神经系统中为神经元提供结构和功能支持外,反应性星形胶质细胞还通过星形胶质细胞增生过程对中枢神经系统的损伤和疾病做出反应9。  

现在已知 NeuN 可以识别 RBFOX3,但最初是在神经元特异性抗体组织学筛查中发现的10。尚不完全清楚 NeuN 的功能,但使用此标记是因为它可对大多数神经元的细胞核染色。除了本视频中的精美数据外,还可以想象使用 CLARITY 查看 GFAP 和 NeuN 来研究头部创伤、短暂性脑缺血和卒中、神经退行性疾病和癌症造成的脑损伤模型。

在整个器官水平上查看数据将打开一个新的分析水平,这种水平在生物学成像—空间关系中一直被忽视。位置信息为肿瘤生物学、器官和系统生物学(在大小、位置和组织范围内)以及发育中的胚胎提供了有用的数据。这些都是可以从大规模透明化组织分析中受益的领域。话虽如此,但与 CLARITY 和其他组织透明化技术相关的挑战却很多。

首先,长距离成像需要专门的目标11 。另外,由于透明化组织的速度和抗体在整个样品中的分散速度,实验需要很长时间(每个步骤需要几天)。此外,由于所需试剂的量,进行实验的成本很高。而且,并非所有可用于免疫荧光的抗体都可用于组织透明化技术12。最后,使用、存储和显示海量图像文件也是一项挑战。无论如何,CLARITY 是一项非凡的技术,我认为其成果值得付出努力!

了解有关透明化成像技术的更多信息

其他参考:

  1. http://www.cycif.org/
  2. http://web.stanford.edu/group/nolan/technologies.html
  3. Gerner M, Kastenmuller W, Ifrim I, Kabat J, Germain RN. 组织成像:一种高度多路复用定量组织成像分析的方法,应用于淋巴结中的树突状细胞亚群的显微解剖。Immunity 2012; 37(2):364-376.
  4. Tsujikawa T, Thibault G, Azimi V, Sivagnanam S, Banik G, Means C, Kawashima R, Clayburgh DR, Gray JW, Coussens LM, Chang YH. 成像流式细胞术的可靠细胞检测和分割揭示了 Th17 细胞异质性。Cytometry A. 2019 Apr; 95(4):389-398.
  5. Komura D, Ishikawa S. 组织病理学成像分析的机器学习方法.计算机结构生物技术. 2018;16:34–42.
  6. http://lifecanvastech.com/technology/
  7. Phatnani H,Maniatis T. 神经退行性疾病中的星形胶质细胞. 冷泉港实验室生物学展望. 2015 (6): a020628.
  8. Yang Z, Wang KK. 胶质纤维酸性蛋白:从中间的细丝组装和神经胶质过多症到神经生物标记.趋势神经科学. 2015; 38(6):364–374.
  9. Sofroniew, M. Astrogliosis. 冷泉港实验室生物学展望. 2015 (2): a020420.
  10. Duan W, Zhang YP, Hou X, Huang C, Zhu H, Zhang QC, Yin Q. Novel insights into NeuN: from neuronal marker to splicing regulator. Mol Neurobiol, 2016, 53:1637-1647
  11. Li W, Germain RN, Gerner MY. 使用透明增强型 3D 显微镜 (Ce3D) 在大体积组织中进行多重定量细胞分析。PNAS 2017;114(35):E7321-E7330
  12. http://wiki.claritytechniques.org/index.php/Immunostaining#Primary_antibodies_used_in_CLARITY_literature

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

主题: IF-IC, 神经科学

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