成功的免疫荧光法:验证的重要性


Ken B 发布于 2017 年 3 月 01 日 03:00:00

IF_Brochure_pt1_Blog_header_1600x200.jpg在含四部分的系列中,第一部分介绍了免疫荧光法。查看实验对照固定及通透

经过数月的努力工作,你的研究已集中在一个你可以用免疫荧光 (IF) 法验证的假设。但你现在必须作出一个选择。你如何决定使用哪种抗体来获得可靠的免疫荧光结果?你如何知道图像是否准确报告了靶标的位置?在这篇帖子中,我们探讨了一些注意事项。

一抗是免疫荧光实验的一种关键组分,其性能会直接影响数据质量。在蛋白印迹 (WB) 实验中检测到一个特异性条带,并不足以保证所选的抗体也在免疫荧光实验中有效。在蛋白印迹分析中,会将蛋白放在会改变蛋白结构的苛刻还原/变性条件下,因此蛋白印迹实验中抗体检测到的表位可能会在免疫荧光实验中被隐藏或无法检测到,因为在这样的实验中,蛋白仍保留其天然状态。

验证特异性以免误导性免疫荧光结果

α-突触核蛋白在脑细胞中高表达,其功能异常会导致神经退行性疾病,如帕金森病。在健康组织中,α-突触核蛋白一般位于突触前末梢,并在此结合突触囊泡。按照制造商建议的各稀释度,CST 科学家将 α-Synuclein (D37A6) XP® 兔单克隆抗体 #4179 和另一家公司的 α-突触核蛋白抗体做了并排比较。两种抗体在蛋白印迹实验中的性能与预期一致。在免疫荧光实验中,在中脑区观察到 #4179 的斑点染色与 α-突触核蛋白在突触前区的位置一致;而另一家公司的抗体则显示点状分布不明显,甚至错误报告为胞核或胞体染色(箭头)。

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“清晰”蛋白印迹并不能充分确保抗体在免疫荧光分析中也有良好性能和可靠性。使用 α-Synuclein (D37A6) XP® 兔单克隆抗体 #4179 或另一家公司的 α-突触核蛋白抗体(左图)对小鼠和大鼠脑细胞的提取物进行蛋白印迹分析。使用 #4179(上排)或另一家公司的抗体(下排)对 [小鼠] 中脑下部和海马体切片进行共聚焦免疫荧光分析(右图)。白色箭头表示用另一家公司的抗体错误标记为 α-突触核蛋白的胞体/胞核。


这项实验说明了应用特定验证的重要性。 

在接下来的几周,我们将发布讨论免疫荧光实验的对照设计、固定和通透注意事项和抗体孵育条件的贴子,届时请查看。你也可以点击下面的链接,下载“成功进行免疫荧光实验的指南”,这是一种方便的资源,其中包含许多提示以及“成功进行免疫荧光实验“的 9 个实验步骤。

下载指南

如果已有一份指南?查看其它有关免疫荧光实验的贴子:

获得发表级免疫荧光图片的 5 个步骤
在开始你的免疫荧光实验前要问的 3 个问题
使用多种抗体进行荧光染色

XP 是 Cell Signaling Technology 的商标。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

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