成功的免疫荧光法:固定和通透


Ken B 发布于 2017 年 3 月 15 日 03:00:00

IF_Brochure_pt3_Blog_header_1600x200.jpg这是有关免疫荧光法的四部分系列中的第三部分。查看验证实验对照的重要性。

抗体的性能是获得可靠免疫荧光 (IF) 结果的一个重要决定因素。同样重要的是,在加入任何抗体之前,制备生物样品 - 在你的实验中使用的细胞或组织。样品固定和通透是决定实验成败的关键步骤。理想的固定剂可以保留“栩栩如生”的样品效果,同时还会通过交联和抑制内源酶快速阻止自溶降解过程。这篇帖子提供了有关使用不同实验步骤时不同抗体会如何发挥最佳性能的例子。

在抗体开发中,CST (Cell Signaling Technology) 科学家测试了不同的方法,为你提供最适合每种抗体的建议固定和通透实验步骤,因此,你无需猜测。

固定剂的选择

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甲醛、福尔马林(一种用低比例甲醇溶解甲醛获得的混合液)和戊二醛等醛类固定剂都是最常用的固定剂。对多数抗体,CST (Cell Signaling Technology) 建议用 4% 甲醛固定(免疫荧光法标准实验步骤)。醛类会与细胞蛋白发生反应和交联,从而固化样品,并使之变得稳定。相比醇类,醛类更能穿透质膜并固定可溶性蛋白,但某些靶标可能会在醛交联中丢失自身的抗原性。

脱水/变性固定剂(如甲醇)会脱去细胞大分子周围的水,导致它们出现原位变性和沉淀。靶标蛋白变性可能会让通常隐藏的表位暴露出来,因此这种方法对某些抗体而言具有优势。但脱水固定剂不太适用于可溶性靶标及修饰状态特异性抗体,如磷酸化抗体。参见产品数据表,了解最佳固定法。

对使用不同固定实验步骤固定的 HeLa 细胞进行并排比较,结果表明 Keratin 8/18 (C51) Mouse mAb #4546 最适合甲醇固定法。相比之下,AIF (D39D2) XP® 兔单克隆抗体 #5318 则最适合甲醛固定法。

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使用 Keratin 8/18 (C51) 小鼠单克隆抗体 #4546(绿色,上排)或 AIF (D39D2) XP® 兔单克隆抗体 #5318(绿色,下排)对经甲醛(左图)或甲醇(右图)固定的 HeLa 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。红色 = Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087。

在进行多重实验时,我要使用哪些固定/通透条件?

如果使用需要不同 CST 实验步骤免疫荧光法标准实验步骤免疫荧光法甲醇实验步骤免疫荧光法甲醇-通透实验步骤)的抗体进行多重实验,你可能需要根据最佳条件来确定使用抗体的优先顺序。在扩大你的实验前,先进行一次比较不同实验步骤的小型测试可能会获得一些信息。

去垢剂或醇类的选择

如果使用交联固定剂,则质膜将仍保持完整,这会使胞内靶标无法接触抗体。因此,应在交联固定之后进行通透,除非你的抗体能检测胞外表位。在 CST (Cell Signaling Technology) 的免疫荧光法标准实验步骤中,在使用封闭步骤固定后(见下一章节),加入了 Triton® X-100 通透。Triton 和其他去垢剂(如 NP-40、TWEEN®、皂素、洋地黄皂苷和 DOTMAC)可去除细胞膜中的不同分子,形成大小不一的“孔”让抗体进入。

或者,也可在固定步骤之后,使用乙醇或甲醇进行醇类通透。这种方法结合了:交联固定剂的快速固定与中间物变性。这可以增强某些靶标的信号,尤其是与细胞器或细胞骨架相关的靶标。如下所示,甲醇通透可提升某些抗体的性能。 

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PDI (C81H6) 兔单克隆抗体 #3501 和 ß-肌动蛋白 (8H10D10) 小鼠单克隆抗体 #3700 最适合甲醇通透法。使用 #3501(绿色)和 #3700(红色)对经 0.3% Triton® X-100(左图)或甲醇(右图)通透的 NIH/3T3 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色假色 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。

 与固定一样,最佳通透方法因抗体而不同。请查阅产品数据表,了解建议的方法,或如有任何疑问,请联系 CST

你也可以下载我们方便的“成功进行免疫荧光实验的指南”,指南中包含这篇帖子中所提及的所有实验步骤以及更多有用的提示。 

下载指南

你是否曾想过,我们是如何提出我们建议的抗体稀释度的?请在接下来的几周回来查看第四部分!

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Cell Signaling Technology、CST 和 XP 均是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。Triton 是陶氏化学公司 (The Dow Chemical Company) 的注册商标。Tween 是 ICI Americas, Inc. 的注册商标。DRAQ5 是 Biostatus Limited 的注册商标。 

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

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