成功的免疫荧光法:实验对照


Ken B 发布于 2017 年 3 月 08 日 03:00:00

IF_Brochure_pt2_Blog_header_1600x200.jpg 在含四部分的系列中,第二部分介绍了免疫荧光法。查看我们有关验证固定及通透的帖子。 

经过数月的努力工作,你的研究已集中在一个你可以用免疫荧光 (IF) 法验证的假设。你已选择抗体,已进行免疫荧光预实验(参见“验证的重要性”),并且蛋白定位也似乎合理。但你如何确定你获得的免疫荧光数据就能代表真正的生物现象呢?我们在这篇帖子中介绍了两个实验对照例子。

要确认样品之间的唯一变化是否在实验变量范围内,以及包括抗体在内的试剂是否如预期一样起作用,加入合适的对照是非常重要的。这样的对照包括药物学处理、添加胞外配体来调控信号转导通路,或比较基因表达(敲除、siRNA等)不同的细胞。通常,变量和对照是并行的,这样就能同时进行固定步骤和后续处理。使用的对照类型取决于实验类型。在接下来的几个部分,我们提供了我们的科学家在 IF-IC 中评估抗体性能时所采用的对照的例子,其中一些你可能想要用来确认对你的细胞类型的特异性。

使用敲除型细胞系来验证靶标特异性

如果你正在研究某种有多个同工型的靶标,那么可以使用敲除型细胞系作为对照可能有用。比如,GSK-3α 和 GSK-3ß 两种基因会编码糖原合成酶激酶 (GSK-3),它们在不同丝氨酸残基被调控。进行免疫荧光实验时,你可能想知道你正在使用的抗体是否能检测一种或两种同工型,还是都不能检测。这可以使用已知目的靶标表达呈阳性或阴性的细胞来确认。在免疫荧光实验中,使用野生型(GSK-3ß 阳性)、GSK-3α 敲除型(GSK-3ß 阳性)和 GSK-3ß 敲除型(GSK-3ß 阴性)小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 证明,GSK-3ß (D5C5Z) XP® 兔单克隆抗体 #12456 可特异性检测正确的同工型。IF_Brochure_pt2_controls_imageA_1200x600.jpg

蛋白印迹分析和免疫荧光分析证明 GSK-3ß (D5C5Z) XP® 兔单克隆抗体 #12456 对 GSK-3ß 具有特异性:使用 #12456(上图)和 GSK-3α/ß (D75D3) XP® 兔单克隆抗体 #5676(下图)对野生型、GSK-3α (-/-) 和 GSK-3ß (-/-) MEF 的提取物进行蛋白印迹分析(左图)。使用 #12456(绿色)对野生型 MEF(上图)、GSK-3α (-/-) MEF(中间)和 GSK-3ß (-/-) MEF(下图)进行免疫荧光分析(右图)。肌动蛋白丝用 DyLight™ 554 Phalloidin #13054 标记。蓝色假色 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。

通过调节靶标磷酸化状态来确认磷酸化特异性

对磷酸化、乙酰化、泛素化、剪切等翻译后修饰 (PTM) 具有特异性的抗体可揭示有关靶蛋白生物功能的重要信息。在某些情况下,PTM 变化可能与表达和/或定位变化相吻合。因此,可以使用 PTM 特异性抗体以及酶或化学激动剂和/或抑制剂来调节靶蛋白的激活状态,从而确认细胞的 PTM 变化。IF_Brochure_pt2_controls_imageB_1200x600.jpg

实验干扰可确认某种抗体的 PTM 特异性。
使用 Phospho-Cyclin D1 (Thr286) (D29B3) XP® 兔单克隆抗体 #3300(绿色)对未处理的(左图)或用蛋白酶 MG-132 单独处理(中间)或用 MG-132 处理后再用 λ 磷酸酶处理(右图)的 HT-1080 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白丝用 DyLight™ 554 Phalloidin #13054 标记。

点击下面的链接,下载“成功进行免疫荧光实验的指南”,这是一种方便的资源,其中包含许多提示以及“成功进行免疫荧光实验“的 9 个实验步骤。

下载指南

如果已有一份指南?查看其它有关免疫荧光实验的贴子:

获得发表级免疫荧光图片的 5 个步骤
在开始你的免疫荧光实验前要问的 3 个问题
使用多种抗体进行荧光染色

XP 是 Cell Signaling Technology 的商标。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

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