简化蛋白质组学:第 2 部分


Claire S 发布于 2015 年 12 月 02 日 03:00:00

抗体垂钓

第 1 部分简要介绍了基于质谱法的蛋白质组学。现在,是时候讨论如何采用这一策略从复杂的生物样品中检测带有翻译后修饰 (PTM) 的肽段了。

天气晴好,泛舟湖上。小船上下摆动,你支起了钓竿,一整个下午都有鱼上钩。也许下一次就能钓到条大鱼。等一下!不要白日做梦幻想垂钓了!实际上,周五下午,天色已晚,而你还在实验工作台旁。显然,你之所以会幻想周末垂钓之旅,是因为你正对某个蛋白质组学实验感到困惑,而蛋白质组学实验与垂钓非常相似。(是的,真的很像!)

例如,你已经将细胞或组织样品消化为一种复杂的短肽混合物。请记住,蛋白质组学中包含多达上百万种蛋白变体,这意味着你的混合物中也包含数百万个肽,其中有的肽经修饰,而有的没有。研究 PTM 的一大挑战是,与未经修饰的肽相比,经修饰的肽在肽混合物中的丰度通常要低得多。有些肽极为罕见。那么,你如何利用质谱法来增加自己检测和定量它们的可能性?首先通过抗体富集或免疫亲和纯化 (IAP) 将 PTM 肽从蛋白混合物中“钓”出来。正如每个渔夫(或渔妇)所知,要想顺利捕到鱼,必须使用合适的鱼饵。那么,让我们看看你的“钓具箱”里有些什么……

  • 标准位点特异性 PTM 抗体:该抗体可以在其周围的特定氨基酸序列环境中检测修饰的氨基酸。例如,一种人磷酸化 Akt1(丝氨酸 473)抗体会包括序列 FPQFpSYSAS。
  • PTM-序列基序抗体(基序抗体):该抗体可在特定基序中检测修饰的氨基酸。例如,Akt1 的底物通常包括一个 RXRXXpS 基序,其中 X 可以是任何氨基酸。丝氨酸残基被磷酸化时,该基序抗体可检测 Akt 底物中的序列 RXRXXS。
  • PTM-特异性抗体(PTM-抗体):该抗体可检测含目的 PTM 的任何残基。例如,乙酰化赖氨酸抗体可检测所有乙酰化赖氨酸残基,无论其侧翼的氨基酸是哪一种。

使用这些抗体使 PTM 肽段富集,然后在 LC-MS/MS 中检测这些富集肽段,这就是 CST 所称的 PTMScan® 方法。PTMScan 可以在单次 LC-MS/MS 中检测和定量成百上千种 PTM 肽。

以上列出的修饰特异性抗体的使用方法各不相同,具体取决于你在实验中尝试解答的问题类型。那么,你应该选择哪种抗体?

PTMScan Direct

如果你知道你正在研究的系统涉及哪种信号转导通路,你就可以进行 CST 所称的 PTMScan Direct。在这一版本的 PTMScan 中,制备了标准位点特异性抗体混合物,并固定在微珠上。该抗体混合物包含标准位点特异性抗体,该抗体可靶向某一信号转导通路中蛋白(例如 Akt/PI3K 信号转导涉及的蛋白)的关键调节位点。这些位点特异性抗体可使肽混合物中含有 PTM 的相应肽发生免疫沉淀,随后可通过 LC-MS/MS 来检测和定量纯化的肽。PTMScan Direct 使我们能够详细了解已知信号转导通路的调控。

PTMScan Discovery

针对基于质谱法的蛋白质组学的另外一种 IAP 方法是 CST 所称的 PTMScan Discovery。与 PTMScan Direct 类似的地方在于它使用经固定的抗体来使某种混合物中的 PTM 肽富集。不像使用标准位点特异性抗体的 PTMScan direct,在 PTMScan Discovery 中,每个 IAP 珠子只固定一种类型的抗体,此类抗体便是 PTM 抗体或基序抗体。这种方法让我们能够捕获任何包含目的 PTM 或 PTM 基序的肽,例如某种特定激酶的底物、乙酰化肽或泛素化肽。

PTMScan Funnel

固定化金属亲和色谱

在进行 LC-MS/MS 之前特异性纯化磷酸化肽的另一策略称为固定化金属亲和色谱 (IMAC)。通过采用经固定的金属离子(通常为 Fe3+),IMAC 利用固有的配位化学来捕捉带有负电荷的磷酸肽。回到我们的钓鱼类比,与 PTMScan 相比,IMAC 更像是用渔网捕鱼。这种方法可以有效地纯化磷酸肽,但靶向性不及 PTMScan Discovery,并且更适合混合物中丰度较高的肽。IMAC 是 PTMScan 的一种高度互补技术。

进行 LC-MS/MS 之前的 PTMScan Discovery 和 IMAC 均旨在检测和定量成百上千种含 PTM 的肽。随后,诀窍在于评估哪些是与后续研究最为相关的候选肽。较好的第一步是确定哪些肽在所运行的多种样品之间(例如,经处理的细胞和未处理的细胞之间,或者癌组织和健康组织之间)丰度差异最大。在此基础上,采用之前的预期生物学知识或通路分析工具,可给定蛋白质组学数据背景。随后,最佳候选肽通过蛋白质印迹、免疫沉淀-蛋白质印迹、siRNA 或过表达研究、位点定向突变发生或其他测定法进行验证,以便为将来研究提供可行性候选肽。

因此你会发现,利用这些技术捕捉肽的成果值得你一整天泛舟湖上的辛苦,而且这些技术将帮助你快速推进研究,让你尽早收网。

简化蛋白质组学帖子中的最后一步以一个从实验台到临床的故事为例,说明了如何使用 PTMScan。

观看“翻译后修饰:针对基于质谱法的蛋白质组学的抗体富集”网络研讨会
 
立即观看
 
 

简化蛋白质组学

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

订阅电子邮件

最新文章

Powered by Translations.com GlobalLink OneLink SoftwarePowered By OneLink