如果我能看到大脑里发生了什么……


Richard C 发布于 2019 年 6 月 05 日 03:15:00

对于几代神经科学家而言,使用免疫组织化学方法在解剖学背景下研究大脑通常意味着一次成像一小片。使用传统的方法获取微米厚的切片、进行固定、染色、成像,最后将所有切片缝合在一起,是一项非常费力的任务,对于大型组织尤为费力。但是,如果您可以“观察”完整的小鼠大脑并识别特定细胞并摆脱所有切片和缝合,又会是什么样的情况呢?

为了做到这一点,将需要克服一些挑战。您将必须能够充分均匀地固定器官,以在组织和分子水平上维持其结构。固定后,组织必须具有足够的多孔性,因此像抗体这样的分子可以完全穿透器官。完成此操作后,您将需要高效、如实地对整个结构进行成像。如何完成这项任务?

输入整个组织的透明方法。2012 年,我首次接触这个想法。作为一名分子神经生物学家,我总是利用传统的免疫染色技术来研究我感兴趣的蛋白质在细胞中或在脑组织本身中何时何地表达,神经科学协会的一张海报引起了我的注意,其标题为“透明化:利用分子表型快速、完全、完整的脑成像技术 (1)”。我想这个标题会引起任何神经科学家的兴趣,“完全、完整的脑”成像,为避免大家错过加粗字体,再此特意强调标题。

我在这张海报上看到的是一种独特的大脑成像方法:使大脑完全透明。

实际上,大脑通常是不透明的,这使得在组织深处的成像有问题。为了克服这些困难,作者使用了一种称为透明化的新技术,通过一种水凝胶固定组织,该水凝胶可物理支撑组织并维持其分子结构,然后使膜脂质透明化。结果是一个完全透明、完全而完整的大脑,可以使用标准共聚焦荧光进行染色和成像。2013 年,这张海报的作者获得了《科学杂志》的年度突破荣誉,同年还因癌症免疫疗法的突破获得认可 (2)。

快速前进 5 年,原始技术得到了发展,该技术现在更普遍地称为“组织透明化”。包括 iDisco、CUBIC、FRUIT、SHIELD/SWITCH 在内的新方法试图通过解决原始的透明化方法的一些局限性。最重要的优化包括更均匀和/或更快速的染色方法,这些方法解决了原始方案中较长、复杂的处理时间和苛刻的条件。一些加工条件会改变组织/蛋白质的结构,从而导致基于抗体的染色信号丢失(由于抗体表位的可用性改变)以及遗传编码标签(如 GFP)的荧光减弱(由于荧光团的改变) 。  

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

从阿尔茨海默病小鼠模型共聚焦重建大脑,并采用由 Kwanghun Chung、Li-Huei Tsai 及其同事提供的 β 淀粉样蛋白 (D54D2) XP® Rabbit mAb #8243 透明化并染色。

最近,麻省理工学院的 Kwanghun Chung 实验室描述了 SHIELD,使用优化的聚环氧化物固定方案,可以更如实地维持组织结构并保持 GFP 的荧光,这是真正的进步,因为基因编码的 GFP 被广泛用于标记脑细胞和结构。结合有效的标记处理工作流程,这些工作流程可将抗体均匀地分散在相关组织中并减少标记时间(请参阅 https://lifecanvastech.com/tissue-processing-21st-century/),这些方法代表了可能使组织的透明化更加可靠、高效和灵活的方法,以使研究人员能够回答特定的生物学问题。

这些组织透明化技术可以解决什么样的生物学问题?利用这些技术,现在可以在特定区域的背景下回答细胞命运的问题,绘制特定细胞群以揭示解剖学回路,检查完整的大脑中精细的突触结构而无需引入伪影。这些问题不仅限于发育或基础神经科学,还适用于理解神经退行性疾病,例如阿尔茨海默病 (AD)。

据认为,包括 β 淀粉样蛋白 (Abeta) 斑块和神经原纤维缠结 (NFT) 在内的 AD 病理标志的动态产生、进展和相互作用都可促使疾病的进展。但是以何种方式呢?Aβ 斑块与哪种类型的细胞和/或结构相互作用?这些相互作用在疾病的早期和晚期是否有所不同? 疾病是否始于大脑的某个区域,也许是开始于大脑一个子区域中的 NFT,生根,然后一直蔓延到整个大脑?哪个在先,是 Aβ 斑块还是 NFT?是否根据疾病的程度或所查看大脑区域的不同而有所不同?

组织透明化技术适用于回答此类问题。如果希望的话,能否在完整的小鼠大脑中检查 Aβ 图景?答案是肯定的。Kwanghun Chung 与麻省理工学院 Li Huei Tsai 合作生成并提供了此类图景的一个示例,研究了使用 CST 的 β 淀粉样蛋白 (D54D2) XP® Rabbit mAb 染色的整个 5XFAD 小鼠的大脑。研究人员使用 SHIELD 组织透明化技术和 CST 抗体,揭示了整个大脑的 Aβ 斑块。在可能产生 AD 潜在治疗的激动人心的进展中,全脑组织透明化术被用于观察在小鼠大脑的背景下,γ 频率刺激引起的 β 淀粉样蛋白 (D54D2) 识别斑块的减少(3,请参阅附图 S3&4)。

这项技术的未来可能是什么?使用扩展显微镜等技术以超出光学衍射极限的分辨率超精细化细节是否可以成为工作流程的一部分 (4, 5)?如何分析这种大量数据以产生有意义的生物学见解?像 LifeCanvas (https://lifecanvastech.com/) 这样的公司是否可以生成利用自动固定和染色机的工作流程,从而使该技术具有更大的可扩展性和更快的速度?最终用户可预期多少抗体优化,或者是否可以将其标准化?可以使用组织透明化技术来研究大脑以外的疾病(例如肿瘤微环境)的标志吗?这些问题肯定会随着该领域的成熟而解决,美国国立卫生研究院每年投资 4 亿美元(6,请参阅 NIH BRAIN 计划)来开发这种整体型技术,将大大有助于研究人员了解我们大脑的实际情况。

阅读有关神经变性的更多信息。

 

参考文献:

1  http://www.abstractsonline.com/Plan/ViewAbstract.aspx?sKey=b4200e23-ad5c-4c94-9c7e-bfd7369b0db6&cKey=88fb0d8a-4673-42ce-9acd-54f883fb1a2e&mKey=%7B70007181-01C9-4DE9-A0A2-EEBFA14CD9F1%7D
2  https://www.sciencemag.org/news/2013/12/sciences-top-10-breakthroughs-2013
3  https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867419301631?via%3Dihub
4  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27454740
5  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30573813
6  https://www.braininitiative.nih.gov/

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

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