你是否曾疑惑应该如何选择上样对照?


Chris S 发布于 2018 年 3 月 21 日 06:15:00

你是否曾疑惑?

对于希望给文献中的蛋白印迹数据带来一定合理性的人来说,上样对照让人十分头疼。上样对照有一些明显的标准。第一,实验条件不能改变上样对照蛋白的水平。第二,对照的分子量必须与目的蛋白不同。第三,也是最重要的一点,检测到的上样对照和目的蛋白的信号必须在一个线性范围内,否则你会发现你的条带用尽了也无法进行定量。 

最常违反的是最后一条标准,科学家宁可作无用的尝试来检测条带的形状和密度,也不重新进行一次印迹实验。通常,需要一些初步的摸索,才能获得合适的蛋白浓度。因此,可能要考虑许多对照,因为对于每一个可以想得到的实验,没有一种蛋白能满足所有这些标准。通常,评估多个上样对照有助于发现至少一个(好的时候多个)能够证实线性在目的蛋白范围内的对照。 

但遗憾的是,可能需要多次稀释你的珍贵样品,才能确定目的蛋白和上样对照的动态范围。正如老木匠所说的,“量两次,切一次”。提前注意一些事项可避免需要返回来重复进行印迹实验,以便在发表之前获得正确的定量数据。或者更糟的是,不满意的第三方审核员可能要求进行新实验来证实发表文章的合理性。 

对于微型凝胶上的每个泳道,我们建议上样 20–50μg 总蛋白。对于大多数靶蛋白和模型系统,使用 CST (Cell Signaling Technology) 抗体检测可得到最佳效果。

上样对照
蛋白

分子

兔单克隆
抗体

小鼠单克隆
抗体

Vinculin 124 kDa Vinculin (E1E9V)
XP® #13901
α-Actinin 100 kDa α-Actinin (D6F6) 
XP® #6487
β-Tubulin 55 kDa β-Tubulin (9F3) #2128 β-Tubulin (D3U1W) #86298
β-Actin 45 kDa β-Actin (D6A8) #8457 β-Actin (8H10D10)
#3700
GAPDH 37 kDa GAPDH (D16H11)
XP® #5174
GAPDH (D4C6R)
#97166
Cofilin 19 kDa Cofilin (D3F9)
XP® #5175
组蛋白 H3 17 kDa Histone H3 (D1H2) XP®
 #4499
Histone H3 (96C10) #3638

 

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美国专利号 5675063。
XP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

主题: 蛋白质印迹法

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