你是否曾想过:磷酸化特异性抗体的真相是什么?


Ken B 发布于 2017 年 7 月 26 日 03:20:00

对未绘制成图的生物信号转导通路进行的早期探索是使用放射性标记磷酸化显影方法进行的。开发出磷酸化特异性抗体来检测和定量蛋白磷酸化,这使研究人员更轻松(减少了要处理的 32P 废物),但解释从这些实验中获得的数据往往需要小心谨慎。激酶家族进化图

在级联激酶和反作用磷酸酶平衡的基础上,可以确定是何时何地通过添加和去除磷酸基来传递信号的。首先观察到在丝氨酸/苏氨酸和组氨酸/天冬氨酸残基上发生蛋白磷酸化修饰,并且随后发现酪氨酸磷酸化。这些蛋白修饰在巨大的互连网络中的蛋白间传递信息,并且几乎涉及从细胞周期到代谢、从神经系统功能到免疫应答以及从组织发育到癌症的每一个重要的生物功能。

为了跟踪信号,你需要了解你的靶标蛋白的磷酸化状态。可检测磷酸化状态下肽基序的抗体是蛋白印迹实验 (WB) 和其他应用中的有价值研究工具。这些抗体包括可广泛检测许多蛋白(例如磷酸化酪氨酸)磷酸化的抗体、可通过邻近残基检测确定的 PTM (翻译后修饰) 基序(伴随着不同程度的简并)的抗体、以及对特定肽中的 PTM(翻译后修饰)具有特异性的抗体。对于大多数做出信号转导假说的科学家,肽特异性磷蛋白抗体都是必选的工具(如果可用)。

在蛋白印迹实验中使用磷蛋白抗体时,必须记住这些修饰的罕见性,了解磷酸肽(磷酸酯)键的易断性,明白存在潜在磷酸酶造成虚假去磷酸化的风险。Cavalier 实验室操作规范会让你难以检测到磷蛋白,无论是通过去掉磷酸基(磷酸酶未被抑制)、蛋白降解(蛋白酶未被抑制),还是通过降低抗体检测的有效性。

下面列出了一些注意事项,请牢记于心:

为了确保你的靶标磷蛋白仍被磷酸化且不被降解,在裂解缓冲液中添加磷酸酶和蛋白酶抑制剂(参见 CST (Cell Signaling Technology) #5872)。你可能还需要考虑激酶抑制剂 (1)。
快速操作,保持冷却并进行声处理,获得总细胞裂解液(参见
蛋白印迹实验步骤)。组织采集和处理的速度、样品冷却和彻底解聚对于最大限度地减少磷酸酶/蛋白酶活性和保持信号至关重要 (1-5)。
注意 pH 值。尽管磷酸化丝氨酸、磷酸化酪氨酸和磷酸化苏氨酸键在非生理性 pH 下很稳定,但对于某些抗体,pH 值变化可能会对抗体检测产生不良影响。此外,如果电泳或转移缓冲液中的 pH 值出现偏离,则还可能对电泳分辨率和膜转移产生不良影响。
CST (Cell Signaling Technology) 建议使用经 1X TBS 稀释的 5% Nonfat Dry Milk #9999、0.1% Tween® 20,以在加入抗体之前阻断膜。我们没有看到背景,或与牛奶蛋白的交叉反应性,因此加入酪蛋白。对于磷酸酶活性,巴氏消毒过程会使牛奶中的所有碱性磷酸酶失活。
查看产品网页/数据表,了解建议的抗体稀释度。注意,使用脱脂奶粉阻断膜时,磷酸化特异性抗体通常会被稀释,并与膜放入 5% BSA 中孵育。
在洗涤/孵育缓冲液中使用 TBS-T,而不是 PBS-T,因为磷酸离子可能会造成干扰。** 
如果计划剥离(stripping)和再检测印迹,则首先请检测磷蛋白,因为剥离过程(stripping)通常会导致磷蛋白抗原丢失/降解。由于可能会出现低丰度抗原,CST 建议在 4°C 下用抗磷蛋白一抗孵育过夜(参见 CST 蛋白印迹实验疑难排解指南)。印迹随后使用总蛋白抗体剥离和再检测,并用作上样/转移对照。
多重荧光报告(参见
荧光蛋白印迹实验步骤)可以确保同时检测总蛋白和磷蛋白,前提是有显影能力。
CST (Cell Signaling Technology) 建议使用
阳性对照来确认检测到的条带是否被磷酸化。还可以使用特异性激活剂和抑制剂来激活信号转导蛋白,或比较使用磷酸化或非磷酸化表位肽进行的阻断。磷酸酶处理通常用作阴性对照,以补充其他实验干扰。
磷蛋白的化学计算丰度通常很低。通过免疫沉淀浓缩抗原可以并且应该能验证无效结果。 

最后,如果所有实验细节均已优化,你应该可以在至少一个磷酸化位点上一次检测到很难发现的磷蛋白。但也可能有多个磷酸化位点,从而导致复杂度增强。随后是时候查看你的本地质谱仪核心设备了,或致电 CST (Cell Signaling Technology) 科学家咨询有关使用我们的 PTMScan® 服务的信息。

** 你可能想知道有关 PBS 在其他实验步骤(即免疫荧光法和流式细胞术实验步骤)中的使用。在这些实验步骤中,大分子与醛交联,并且存在于三羟甲基氨基甲烷(TBS 的组分)中的伯胺会产生干扰,从而对 PBS 有利。PBS 和 TBS 在蛋白印迹实验中的重要性历来有些争议,并且可能具有抗体/表位特异性。

参考文献:

  1. V. Espina et al., A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process. Mol Cell Proteomics 7, 1998-2018 (2008).
  2. K. A. David et al., Surgical procedures and postsurgical tissue processing significantly affect expression of genes and EGFR-pathway proteins in colorectal cancer tissue. Oncotarget 5, 11017-11028 (2014).
  3. A. S. Gajadhar et al., Phosphotyrosine signaling analysis in human tumors is confounded by systemic ischemia-driven artifacts and intra-specimen heterogeneity. Cancer Res 75, 1495-1503 (2015).
  4. S. Gundisch et al., Critical roles of specimen type and temperature before and during fixation in the detection of phosphoproteins in breast cancer tissues. Lab Invest 95, 561-571 (2015).
  5. A. P. Theiss, D. Chafin, D. R. Bauer, T. M. Grogan, G. S. Baird, Immunohistochemistry of colorectal cancer biomarker phosphorylation requires controlled tissue fixation. PLoS One 9, e113608 (2014).

 

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

订阅电子邮件

最新文章

Powered by Translations.com GlobalLink OneLink SoftwarePowered By OneLink