CRISPR:《科学》杂志的 2015 年年度科学突破


Liana G 发布于 2016 年 6 月 29 日 03:30:00

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CRISPR 是一种精巧的基因编辑工具,它已然席卷了科学界。它有一个朗朗上口的名字,出现在所有其他出版物中,而且与争夺它的知识产权有关的法律纠纷层出不穷 (1);尽管出现还不到 4 年,它的使用已经引发了一系列与其伦理影响有关的峰会,并且仍被《科学》期刊评为“年度科学突破” (2)。为了让你对其有更清楚的了解,它的其他竞争者是“新视野号 (New Horizon) 对矮行星冥王星的史诗级访问”,“在脑中发现淋巴系统”以及“埃博拉疫苗”。 

好了,你已经明白了 CRISPR 非常重要,但它究竟是什么?科学家们又为什么对它如此痴迷?

CRISPR 定义

成簇的规律间隔短回文重复序列(或 CRISPR)是源于原核生物基因组的重复序列(同向重复序列)。它们之间有“间隔区”,即可证明过去发生的侵入的病毒源性独特 DNA 序列。当被某种病毒再次攻击时,一种细菌会转录相关的“间隔区”,从而产生单链非编码“向导”RNA,该 RNA 可以:1) 与入侵者独有的间隔序列进行 Watson-Crick 碱基配对;2) 募集 CRISPR 元素上游基因编码的 CRISPR 相关 (Cas) 核酸内切酶。Cas 核酸内切酶可裂解活化外来病毒 DNA,从而扰乱病毒复制。因此,CRISPR 是免疫记忆的一种形式,可抵抗侵入性基因元件。在免疫学家看来,这本身就是一个令人震惊的发现,并且是在几年前偶然发现的 (3, 4)。现在,人们已经知道绝大多数细菌的基因组都携带 CRISPR。几年前发现的是 CRISPR/Cas9 系统是一个模块化系统,我们能将其设计为一种基因编辑工具,以便相对容易地操纵任何目的基因组(5, 6 中已论述)。

将 CRISPR 作为一种研究工具

在细菌中,Cas9 与含 crRNA (CRISPR RNA) 和 tracrRNA(反式激活 crRNA)的双向导 RNA 一起自然发挥作用。crRNA 碱基对的 5’ 末端与靶标 DNA 配对,而其 3’ 末端与 tracrRNA 形成一个双链茎环结构,以促进 Cas9 募集。现已表明,结合两种序列的嵌合单向导 RNA,或 sgRNA 可成功支持 Cas 核酸内切酶的功能 (7)。因此,通过设计含有与目的基因互补的序列的 sgRNA,研究人员可以对 Cas 酶,通常是 Cas9(称为 Cas II 系统)进行编程,以在任何指定物种基因组内的所需位点上剪切 DNA。虽然 sgRNA 有助于 Cas9 找到目的序列,但是 Cas9 结合该序列需要有一个相邻的三核苷酸前间隔序列邻近基序 (PAM),其作为 Cas9 用于进行锁定的分子把手。剪切活动造成的钝性 DNA 双链断裂 (DSB) 会触发 DNA 修复反应,称为非同源末端连接 (NHEJ)。由于其易错性质,NHEJ 会在切割位点引入插入或缺失(插入缺失),导致基因表达破坏。此外,当伴有模板 DNA 和带有 DNA 切割酶而不是核酸酶活性的 Cas9 突变形式时,这个系统可用于使 DNA 修复分子组偏向高保真同源定向修复 (HDR) 机制,以达到平衡来形成基因插入。因此,可对某些基因组区域进行标记,以便在体内观察基因,而且可修复有损功能蛋白表达的突变基因区域,从而缓解肌肉萎缩症等病情 (8, 9)。显然,引入可作为引入精确碱基替换(突变)物的模板的多个向导 RNA 和单链 DNA 寡糖核酸可协调体内(通常在小鼠中)多种基因缺失和插入(10)。这在很大程度上实现了对多基因现象的研究,例如突变组合在肿瘤发生中的作用。 

一直以来,以产生敲入或敲除小鼠为目标的体内基因靶向都是费力耗时的工作,而现在 CRISPR 使这项工作变得如“漫步公园”一样容易。

这只是使用 CRISPR/Cas9 可实现和已实现的无数目标中的一小部分。其他创新应用是:去除逆转录病毒元件的猪基因组,因此将猪器官异种移植到人体中可成为一种安全可行的选择 (11)、筛选全基因组以检测引起化疗药物耐药性的基因 (12),以及对人多精受精卵(体外受精无法独立存活的产物)应用这个系统,以尝试纠正会引起遗传性血液疾病的基因缺陷 (13)。后一项由黄军就带领的研究揭露了 CRISPR/Cas9 系统的缺陷,包括脱靶效应,以及被选择作为用来修补裂解活化位点的 DNA 修复机制(NHEJ 或 HDR)的方式具有变化无常和无法预测的特征 (13)。该研究发表于 2015 年 5 月,提出了科学界的一些重大伦理问题,并警示了各种危险信号。事实上,在全球范围内一直都有关于这项技术的伦理意义的讨论,CRISPR 领域的开拓者 Jennifer Doudna 呼吁召开一次国际峰会来吸引大家对这个主题的关注 (14)。另外,黄军就被《自然》评选为 2015 年“年度十大人物”之一,这位中国年轻科学家被称为“胚胎编辑人”,位于榜上第 2 位。

CRISPR 与 RNAi

如果你认为 sgRNA 与沉默 RNA (siRNA) 之间有相似之处,这是情有可原的,它是可介导基因表达翻译后下调的短单链 RNA。这种内源性机制已被广泛采用,并依赖 Argonaute 蛋白家族来实现 mRNA 降解,以及随后的“敲下”基因产物。其中区别在于:siRNA 调节 mRNA 水平的基因表达时,CRISPR/Cas9 核糖核蛋白复合体会在基因组水平起作用,从而导致基因“缺失”。因此,CRISPR/Cas9 是一种基因编辑工具,类似于转录激活因子样效应子核酸酶 (TALEN) 和设计物锌指 (ZNF) 核酸酶。相比之下,CRISPR 系统更具吸引力,因为它易于设计、可扩展且价格实惠。其通过 Addgene 等开源非盈利分销商提供,这有助于推动这项技术的无缝使用。 

这项技术的另一个吸引人的特性是,仅需沿着 Cas9 mRNA 加入不同向导 RNA 即可实现多重基因编辑 (15,16)。

如需了解有关使用 TALEN、ZNF 和 CRISPR/Cas9 进行基因编辑的利弊的详细信息,Jackson Laboratory 的一篇深度博文值得一看。

结论

总之,CRISPR 技术的开拓者认为它可以与 PCR 等通用工具相提并论。在促进科学进步方面,它大概能够像基因组测序一样具有革命性。最终,研究人员欣然接受这种技术也就不足为奇了。如果你也是其中之一,也许你会发现自己也需要 CST 的 Cas9 抗体 ; )

祝你编辑愉快!

参考文献:

  1. Ledford H (2016) Bitter fight over CRISPR patent heats up. Nature 529(7586), 265.
  2. Travis J (2015) Making the cut. Science 350(6267), 1456–7.
  3. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Soria E (2005) Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J. Mol. Evol. 60(2), 174–82.
  4. Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P (2007) CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 315(5819), 1709–12.
  5. Hsu PD, Lander ES, Zhang F (2014) Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell 157(6), 1262–78.
  6. Sternberg SH, Doudna JA (2015) Expanding the Biologist's Toolkit with CRISPR-Cas9. Mol. Cell 58(4), 568–74.
  7. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337(6096), 816–21.
  8. Tabebordbar M, Zhu K, Cheng JK, Chew WL, Widrick JJ, Yan WX, Maesner C, Wu EY, Xiao R, Ran FA, Cong L, Zhang F, Vandenberghe LH, Church GM, Wagers AJ (2016) In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science 351(6271), 407–11.
  9. Dow LE, Fisher J, O'Rourke KP, Muley A, Kastenhuber ER, Livshits G, Tschaharganeh DF, Socci ND, Lowe SW (2015) Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nat. Biotechnol. 33(4), 390–4.
  10. Yang L, Güell M, Niu D, George H, Lesha E, Grishin D, Aach J, Shrock E, Xu W, Poci J, Cortazio R, Wilkinson RA, Fishman JA, Church G (2015) Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses (PERVs). Science 350(6264), 1101–4.
  11. Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh OO, Barcena C, Hsu PD, Habib N, Gootenberg JS, Nishimasu H, Nureki O, Zhang F (2015) Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature 517(7536), 583–8.
  12. Liang P, Xu Y, Zhang X, Ding C, Huang R, Zhang Z, Lv J, Xie X, Chen Y, Li Y, Sun Y, Bai Y, Songyang Z, Ma W, Zhou C, Huang J (2015) CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell 6(5), 363–72.
  13. Doudna J (2015) Genome-editing revolution: My whirlwind year with CRISPR. Nature 528(7583), 469–71.
  14. Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R (2013) One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 153(4), 910–8.
  15. Platt RJ, Chen S, Zhou Y, Yim MJ, Swiech L, Kempton HR, Dahlman JE, Parnas O, Eisenhaure TM, Jovanovic M, Graham DB, Jhunjhunwala S, Heidenreich M, Xavier RJ, Langer R, Anderson DG, Hacohen N, Regev A, Feng G, Sharp PA, Zhang F (2014) CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell 159(2), 440–55.

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

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