CRISPR：2015 年《科学》杂志年度突破

作为一种精巧的基因编辑工具，CRISPR 已然席卷科学界。它有个朗朗上口的名字，出现在所有其他出版物中，而且在一场涉及主张其知识产权的变幻莫测的法律纠纷中充当主角 (1)；尽管诞生还不到 4 年，它的用途却已引发一系列与其伦理影响有关的峰会，《科学》杂志将它评为“年度科学突破” (2)。为了让你有所了解，它的其他竞争者是“新视野号 (New Horizon) 史诗级造访矮行星 — 冥王星”、“脑中发现淋巴系统”以及“埃博拉疫苗”。 

好了，你已经明白 CRISPR 非常重要，但它究竟是什么？科学家们又为何对其如此痴迷？

CRISPR 定义

成簇的规则间隔的短回文重复序列或 CRISPR 是原核生物基因组固有的重复序列（直接重复序列）。它们之间散布着“间隔区”——携带过去入侵证据的病毒源独特 DNA 序列具有。在病毒反复攻击时，细菌可以转录相关的“间区”以产生单链非编码“导引”RNA，这些 RNA 可以：1) 与入侵者独有的间区序列发生 Watson-Crick 碱基配对，并且 2) 招募由 CRISPR 元件上游基因编码的 CRISPR 相关 (Cas) 核酸内切酶。Cas 核酸内切酶可以切割外来病毒 DNA，从而破坏病毒复制。因此，CRISPR 是一种免疫记忆形式，可赋予针对侵入性遗传元件的抗性。从免疫学家的观点看，这本身就是一个惊人的发现，几年前偶然揭秘 (3, 4)。现在已知，大多数细菌在基因组中携载 CRISPR。仅在几年前才披露 CRISPR/Cas9 系统有模块性，而我们可以将这个系统设计成一种基因编辑工具，以相对最小的付出操纵任何目的基因组（综述见 5,6）。

CRISPR 作为一种研究工具

在细菌中，Cas9 天然与含 crRNA (CRISPR RNA) 和 tracrRNA（反式激活性 crRNA）的双导引 RNA 一起发挥作用。crRNA 碱基对的 5’ 末端与靶标 DNA 发生碱基配对，而其 3’ 末端与 tracrRNA 形成一个双链茎环结构，以促进 Cas9 招募。现已证明，合并这两个序列的嵌合单导引 RNA 或 sgRNA 成功支持 Cas 核酸内切酶的功能 (7)。因此，通过设计对目的基因有序列互补性的 sgRNA，研究人员可以对 Cas 酶（最经常是 Cas9（称为 Cas II 系统））编程，在任何指定物种的基因组内部所需的基因座处切割 DNA。虽然 sgRNA 有助于 Cas9 找到目的序列，但是 Cas9 与该序列的结合需要一个邻近的三核苷酸前间区序列邻近基序 (PAM) 存在，该基序充当 Cas9 发生附着的分子把手。因切割事件造成的平端 DNA 双链断口 (DSB) 会触发 DNA 修复反应，称为非同源末端连接 (NHEJ)。由于其易错性质，NHEJ 在切割位点引入插入或缺失（插入缺失），导致扰乱基因表达。此外，当伴有模板 DNA 和有 DNA 切口酶活性而非核酸酶活性的 Cas9 突变形式时，这个系统可用于使 DNA 修复装置偏向高保真同源性定向修复 (HDR) 机制，创建基因插入。因此，可如此标记某些基因组区域，从而基因可以在体内可视化，而且可以恢复有损功能性蛋白表达的突变基因区域，从而缓解肌肉萎缩症等病症 (8, 9)。值得注意地，可以通过引入可充当模板以引入精确碱基替换（突变）的多种导引 RNA 和单链 DNA 寡糖核酸，体内（通常在小鼠中）协调多种基因缺失和插入(10)。这很大程度上使得研究多基因现象（例如突变组合在肿瘤发生中的作用）成为可能。 

旨在产生敲入或敲除小鼠的体内基因打靶工作历来既极度费力，又十分耗时，而现在 CRISPR 使这项工作变得如“漫步公园”一样轻松。

这只是可以用且已经用 CRISPR/Cas9 实现的无数事情中的一小部分。其他的创新性应用包括从猪基因组去除逆转录病毒元件，从而向人体异种移植猪器官是一种安全可行的选择 (11)；大型全基因组筛选以识别导致化疗药物耐药性的基因 (12)，以及该系统用于人类多精合子（无活力的体外受精副产物）中试图纠正导致遗传性血液疾病的基因缺陷（13）。黄俊久主持的一项最近研究有助揭示 CRISPR/Cas9 系统的缺陷，包括脱靶效应以及选择 DNA 修复机制（NHEJ 或 HDR）修补切割位点的方式反复无常且不可预测 (13) 。该研究于 2015 年 5 月发表，在科学界内部引发重大伦理关注，并招致各种批评。事实上，全球范围一直就这项技术的伦理影响进行讨论，CRISPR 领域的先驱 Jennifer Doudna 呼吁召开国际峰会关注该主题 (14)。顺带一提，黄俊久曾入选《自然》杂志 2015 年“年度十大重要人物”名单。这位年轻的中国科学家号称“胚胎编辑者”，位列该名单第二。

CRISPR 与 RNAi

可以原谅您认为 sgRNA 类似于沉默性 RNA (siRNA) ，后者是介导翻译后基因表达下调的单链短 RNA。这种内源性机制已广泛采用并依赖于 Argonaute 蛋白家族来实现 mRNA 降解和后续“敲减”基因产物。其中存在差异：虽然 siRNA 在 mRNA 层面调节基因表达，但 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白复合体在基因组层面起作用，驱动基因“缺失”。因此，CRISPR/Cas9 是一种基因编辑工具，近似于 TALEN（转录激活因子样效应子核酸酶）和设计者锌指 (ZNF) 核酸酶。相比之下，CRISPR 系统更具吸引力，因为它易于设计、可扩展且价格合理。它通过像 Addgene 这样的开源非营利分销商提供，有助于推动该技术的无缝采用。

这项技术的另一个引人注目特性是，连同 Cas9 mRNA 一起单纯引入不同的导引 RNA 就可能进行多重基因编辑 (15,16)。

如需进一步了解有关使用 TALEN、ZNF 和 CRISPR/Cas9 进行基因编辑的利弊信息，一篇来自 Jackson Laboratory 的深度博文值得一看。

结论

总之，CRISPR 技术的先驱者们认为该技术与 PCR 等通用工具旗鼓相当。可以说，它如同基因组测序已经加速科学进步那样有推动力和革命性。最终，研究人员已张开双臂拥抱这项技术并不令人惊讶。如果您是其中一员，您可能会发现自己需要 CST的 Cas9 抗体 ）

祝你编辑愉快！

参考文献：

1. Ledford H (2016) Bitter fight over CRISPR patent heats up. Nature 529(7586), 265.
2. Travis J (2015) Making the cut. Science 350(6267), 1456–7.
3. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Soria E (2005) Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J. Mol. Evol. 60(2), 174–82.
4. Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P (2007) CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 315(5819), 1709–12.
5. Hsu PD, Lander ES, Zhang F (2014) Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell 157(6), 1262–78.
6. Sternberg SH, Doudna JA (2015) Expanding the Biologist's Toolkit with CRISPR-Cas9. Mol. Cell 58(4), 568–74.
7. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337(6096), 816–21.
8. Tabebordbar M, Zhu K, Cheng JK, Chew WL, Widrick JJ, Yan WX, Maesner C, Wu EY, Xiao R, Ran FA, Cong L, Zhang F, Vandenberghe LH, Church GM, Wagers AJ (2016) In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science 351(6271), 407–11.
9. Dow LE, Fisher J, O'Rourke KP, Muley A, Kastenhuber ER, Livshits G, Tschaharganeh DF, Socci ND, Lowe SW (2015) Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nat. Biotechnol. 33(4), 390–4.
10. Yang L, Güell M, Niu D, George H, Lesha E, Grishin D, Aach J, Shrock E, Xu W, Poci J, Cortazio R, Wilkinson RA, Fishman JA, Church G (2015) Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses (PERVs). Science 350(6264), 1101–4.
11. Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh OO, Barcena C, Hsu PD, Habib N, Gootenberg JS, Nishimasu H, Nureki O, Zhang F (2015) Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature 517(7536), 583–8.
12. Liang P, Xu Y, Zhang X, Ding C, Huang R, Zhang Z, Lv J, Xie X, Chen Y, Li Y, Sun Y, Bai Y, Songyang Z, Ma W, Zhou C, Huang J (2015) CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell 6(5), 363–72.
13. Doudna J (2015) Genome-editing revolution: My whirlwind year with CRISPR. Nature 528(7583), 469–71.
14. Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R (2013) One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 153(4), 910–8.
15. Platt RJ, Chen S, Zhou Y, Yim MJ, Swiech L, Kempton HR, Dahlman JE, Parnas O, Eisenhaure TM, Jovanovic M, Graham DB, Jhunjhunwala S, Heidenreich M, Xavier RJ, Langer R, Anderson DG, Hacohen N, Regev A, Feng G, Sharp PA, Zhang F (2014) CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell 159(2), 440–55.