更好地进行免疫组织化学实验的 4 个步骤:第 1 步 - 抗原修复


Carolyn P 发布于 2017 年 5 月 24 日 03:00:00

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周五晚上,你本可以与朋友出去玩,但你却躲在一个放满了显微镜的小黑屋里。那时候,在实验室度过一晚看起来好像是一个不错的选择,因为你确信这次的免疫组织化学实验将揭开一些对你而言虽小但却很重要的宇宙之谜。此刻,你呆坐着这里,咒骂着宇宙和宇宙中的每个人,因为你盯着显微镜时看到的所有东西都模糊不清。谁说的对照有用?没有像想象的那样。你失败了。

接下来要怎样?如果你像我一样,你就会将玻片扔进垃圾桶里,重新振作起来去找你的朋友们。明天再重新评估实验吧。

你要从哪里开始呢?你或许知道一个高度特异性、高亲和力的一抗是成功进行 IHC(免疫组织化学)的关键。但你是否知道决定系统 pH 值和离子强度的配套试剂(即缓冲液等)也同样重要?这些试剂会影响一抗结合其表位,还会显著影响检测结果。

为了帮助你选择最适合你的实验的试剂(以及确保呆在实验室的这几个周五夜晚都是值得的),我们将在接下来的几篇文章中回顾配套试剂会如何影响 IHC(免疫组织化学)。例如,我们会讲述我们对优化其中一种抗体 — PLK1 (208G4) 兔单克隆抗体的实验步骤的经验。

 在我们首先测试这个抗体时,根据我们的标准实验步骤 (A),它无法产生信号。逐一更换配套试剂后,我们可以在不改变一抗稀释系数的情况下,产生一个较强的纯净信号。

第 1 步:抗原修复

福尔马林等交联固定剂常用于制备 IHC(免疫组织化学)样品,因为它们会保留组织的结构完整性,有助于维持组织架构。遗憾的是,这些固定剂可能会隐藏你的抗体要检测的表位。

有几种方法可用来显示在固定过程中被隐藏的表位。这些方法包括依赖于蛋白酶 K 等酶的蛋白水解诱导抗原修复法,或者利用热来解开交联键和分解蛋白的热诱导表位修复法 (HIER)。其中任意一种方法都能显示表位,使它更容易结合一抗,更顺利地进行 IHC(免疫组织化学)染色。

IHC (免疫组织化学) 抗原修复

在 CST (Cell Signaling Technology),我们最常用的抗原修复方法是 HIER,所以我们接下来要详细探讨这种方法。HIER 涉及对组织切片进行加热和冷却,同时要将它们浸没在有明确缓冲能力的溶液中。缓冲液的 pH 值 有助于在温度恢复至正常水平后保持蛋白解旋,因此系统 pH 值范围应根据目的抗体-表位相互作用进行优化。微酸性缓冲液柠檬酸 (pH 6.0) 能有效修复各种表位,但有些表位可能需要偏碱性的缓冲液,如 EDTA (pH 8.0)。

我们使用柠檬酸缓冲液进行 HIER,同时优化 PLK1 (208G4) 兔单克隆抗体 实验步骤,因为它适用于最广泛的表位。尽管我们逐渐更换为其他配套试剂,但会始终使用这种方法。

点击此处,了解第 2、3 和 4 步...  

 


这是有关如何改进 IHC(免疫组织化学)实验步骤的两部分系列中的第一部分。如需更多有用的提示,请点击下面的按钮下载“成功进行 IHC(免疫组织化学)的指南”。

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仅供研究使用。不得用于诊断流程。

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