CST 博客: 实验室展望

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四个步骤获得更好的免疫组织化学:第 1 步 - 抗原修复

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星期五晚上,您本来可以和您的朋友一起出去玩,但您却被困在一个摆满显微镜的黑暗小房间里。 在实验室度过一个晚上在当时似乎是一个不错的选择,因为您确信该免疫组织化学 (IHC) 会向您揭示一些微小但重要的宇宙奥秘。但此刻您呆坐着这里,诅咒着宇宙和宇宙中的每个人,因为您盯着显微镜时看到的所有东西都模糊不清。对照是否有效?

没有像想象的那样。你失败了。

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IHC 疑难解答

接下来要怎样?如果你像我一样,你就会将玻片扔进垃圾桶里,重新振作起来去找你的朋友们。明天再重新评估实验吧。

你要从哪里开始呢?您或许知道一个高度特异性、高亲和力的一抗是成功进行 IHC(免疫组织化学)的关键。但你是否知道决定系统 pH 值和离子强度的配套试剂(即缓冲液等)也同样重要?这些试剂会影响一抗结合其表位,还会显著影响检测结果。

为了帮助你选择最适合你的实验的试剂(以及确保呆在实验室的这几个周五夜晚都是值得的),我们将在接下来的几篇文章中回顾配套试剂会如何影响 IHC(免疫组织化学)。例如,我们会讲述我们对优化其中一种抗体 — PLK1 (208G4) Rabbit mAb #4513 的实验步骤的经验。

 在我们首先测试这个抗体时,根据我们的标准实验步骤(图 A),它无法产生信号。逐一更换配套试剂后,我们可以在不改变一抗稀释系数的情况下,产生一个较强的纯净信号。

IHC (免疫组织化学) 抗原修复

第 1 步:抗原修复

福尔马林等交联固定剂常用于制备 IHC(免疫组织化学)样品,因为它们会保留组织的结构完整性,有助于维持组织架构。遗憾的是,这些固定剂可能会隐藏你的抗体要检测的表位。

有几种方法可用来显示在固定过程中被隐藏的表位。这些方法包括依赖于蛋白酶 K 等酶的蛋白水解诱导抗原修复法,或者利用热来解开交联键和分解蛋白的热诱导表位修复法 (HIER)。其中任意一种方法都能显示表位,使它更容易结合一抗,更顺利地进行 IHC(免疫组织化学)染色。

在 CST,我们最常用的抗原修复方法是 HIER,因此这就是我们将要详细探讨的方法。HIER 涉及对组织切片进行加热和冷却,同时要将它们浸没在有明确缓冲能力的溶液中。缓冲液的 pH 值 有助于在温度恢复至正常水平后保持蛋白解旋,因此系统 pH 值范围应根据目的抗体-表位相互作用进行优化。微酸性缓冲液柠檬酸 (pH 6.0) 能有效修复各种表位,但有些表位可能需要偏碱性的缓冲液,如 EDTA (pH 8.0)。

我们使用柠檬酸缓冲液进行 HIER,同时优化 PLK1 (208G4) 兔单克隆抗体 实验步骤,因为它适用于最广泛的表位。尽管我们逐渐更换为其他配套试剂,但会始终使用这种方法。

阅读下一篇帖子(该系列由两部分组成):


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