抗体验证 101


Susan K 发布于 2018 年 3 月 07 日 06:15:00

验证

作为 CST (Cell Signaling Technology) 的一名开发科学家,人们有时会问我,我的工作到底是什么。我通常会回答“我负责制造抗体”,但这并不完全正确。

我的工作中最具挑战性的部分是确定我们发布的抗体是否能检测出它们应检测到的内容(敏感性),而不是其他任何东西(特异性)。对于大多数靶标,我会使用下面的技术进行蛋白印迹实验。

过表达的蛋白

对于每一个项目,我们都使用多种抗体。对过表达的蛋白测试这些抗体的主要目的是:排除根本不能检测出目的靶标的抗体。当蛋白表达水平异常高时,这极少发生,但信号强度也能提供一些关于抗体相对强度的信息。

尽管过表达系统在研究中经常使用,但使用这种系统进行验证还不够。研究人员需要纯净、效果强的特异性抗体来研究各种蛋白,包括天然环境下的蛋白、某种细胞裂解物中大都不明确的蛋白混合物中的蛋白、活细胞或固定细胞和组织表面的蛋白。

内源性系统

在未处理的或经生物相关方式处理的细胞/细胞系中,如果我们检测到某种蛋白,我们就会称之为内源性表达。

为什么不在一次蛋白印迹实验中分析几种常见的细胞系提取物,然后检测预期大小的条带呢?一种抗体和表观分子量与其目的靶标趋同的蛋白发生交叉反应的频率令人惊讶,因此我们必须采取措施来避免选择错误的抗体。

一个简单的方法: 有些蛋白已知在某些细胞系中表达,但不在其他细胞系中表达。p53 就是其中一个很好的例子。我们可以检测经证实结构性表达 p53,缺失 p53,或需要诱导 p53 表达的细胞系。

大多数蛋白并非如此简单,这意味着没有一种细胞系明确呈阳性或阴性表达。在这些情况下,我们搜索文献,来寻找比较细胞系或组织类型中蛋白表达的研究,或用可刺激 DNA 损伤或凋亡等过程的化学物质来诱导表达的研究。我们还可以依赖公共数据库给我们展示相关基因表达。这些数据库可以用来量化 mRNA 的相对丰度,mRNA 的相对丰度可能与转译蛋白的相对丰度有关或无关。我们使用所有这些技术来提供最有说服力的证据,证明某种抗体可以/不可以检测目的靶标。

我们会比较转染蛋白研究与内源性蛋白研究的结果。对转染蛋白最有效的抗体对内源性系统也应最有效。

敲除

当我们知道了哪些细胞系表达我们的靶标时,就可以使用敲除方法。遗憾的是,我们不能始终使用敲除系统。例如,许多蛋白是细胞活性或增殖所必需的,因此敲除蛋白在敲除过程后不能存活。此外,一些细胞系无法高效转染敲除试剂,因此如果我们的靶标只在“难以转染”的细胞系中表达,我们可能就无法使用敲除工具来进行抗体验证了。

这就是为什么你可能只能看到一小部分用敲除方法验证的抗体,但如果可行,敲除方法会是一个强大的工具。

许多抗体无法通过验证

在这整个严格的验证过程中,我们验证失败的抗体比验证成功发布的抗体还多。有时,我们不得不重新开始。重要的是,在我们手上验证失败的抗体不会到达我们客户的手中,也不会出现在研究出版物、海报或报告中。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

主题: 抗体验证

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