蛋白质印迹法标准化：我设置的上样对照是否正确？

你正在收集你所有实验中的数据，并准备在年度进度报告时提交给你的顾问和论文委员会。你有一个有趣的假设，你还有一种经验证可在蛋白印迹实验 (WB) 中检测靶蛋白的抗体。该条带的分子量是正确的，并且靶蛋白的表达正如你预测的那样改变。

现在，您知道 — 并且百分之百确定 — 当那张展示幻灯片出现时，委员会中将有人询问关于上样对照问题。

解释蛋白质印迹法数据

无论是设置新一批的 WB 实验，还是解释文献中的 WB 数据，在比较 WB 条带时都应该记住两个问题：

1. 泳道是否等量上样？
2. 信号是否处于检测的线性范围内？

为了补偿样品变化并确保等量上样，通常以 β-肌动蛋白或 GAPDH 等“管家”蛋白的上样对照形式测定细胞蛋白含量。

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上样对照标准化的注意事项 

理论上，印迹物上持家蛋白质的量正比于细胞数目，但这是一个可能有误导性的假设，尤其单一蛋白质用于标准化时是这样¹。尽管使用单一上样对照司空见惯，但增加种数将导致变异性更小。最好考虑使用 5 种上样对照。^{2, 3}

遗憾的是，上样对照蛋白通常远比目的蛋白富集。当在单一稀释度下测定对照和靶蛋白时，更富集的蛋白的信号可能较为饱和，会超过检测线性动态范围。饱和对照条带不完全报告泳道之间的差异。你可能会理解这个问题如何能强化关于等量上样的假设，从而可能得出关于实验变量的虚假结论！

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有时，过量上样和饱和会导致残缺印迹，而不是有序条带，或有“燃尽状”或“凹陷状”中心的条带，表明 HRP 偶联二抗已耗尽化学发光试剂的局部浓度。这可能伴随着膜上有褐色斑点，即过氧化物酶过度活化的一种副产物。

以下显示的是这种现象的一个极端例子：

但请注意，你的印迹上不存在“怪异”条带或褐色斑点可能并不指示线性信号。即使对照条带显得相当有序，但它们仍可能是饱和的。²

证明上样对照的线性

为了展示上样对照和目的蛋白二者的线性，可在同一个印迹物上加载一系列样品稀释物或同时转移多个印迹物，以避免转移效率变异。^2,3 滴定蛋白质输入、一抗和/或化学发光试剂可能对实现获得线性为必需，特别对高表达的上样对照是这样。在下面的例子中，需要更长和更短曝光才足以分别获得 HNF1 和 GAPDH 的线性信号。

经动画以显示两种曝光，使用 HNF1α (D7Z2Q) Rabbit mAb #89670（左图）或 GAPDH (D16H11) XP^® Rabbit mAb #5174（右图）对来自各种细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。

蛋白印迹信号也高度取决于检测方法。与胶片相比，使用电荷耦合器件 (CCD) 相机检测增强型化学发光 (ECL) 可产生出色的线性动态范围。如果数字信号饱和，则可以使用软件设置来显示红色像素。荧光扫描（使用与荧光染料而不是过氧化物酶偶联的二抗）经证实可避免发光化学的固有限制，因而更好。

在设置实验时，这些方法可能意味着更少的梯度稀释次数。但如果你的实验室无法使用最新最好的技术，你也可以使用传统 ECL 和胶片获得较好的数据，但需要你花时间设置实验，以解决等量上样和动态范围问题。

总而言之，使用多个上样对照显然是一个耗费时间和试剂的问题。一种愈加可行的替代方法是测定每个样品泳道中的总蛋白上样量，这是多对照概念的一种逻辑延伸，无需探测多个上样对照。测定总蛋白涉及对每个泳道¹ 的蛋白条带或至少多个离散条带³ 进行染色和扫描。谨慎的做法是确认染色剂不会干扰后续的免疫检测（可能取决于抗体），或者进行二重印迹实验，一个针对总蛋白，另一个针对抗体。

避免常见的 WB 失误

对于许多研究生和博士后，可能觉得进行蛋白印迹实验是“例行常规”。但重要的是，要记住，解释蛋白印迹实验的数据时（对任何实验都一样），细节决定成败。仔细考虑样品制备、转移条件和一抗等问题，将有助于您避免失误。^{2, 4-5}

到了发表的时候，记得提供所有详细信息，以便其他人准确评估结果并重复做实验。换言之，负责地进行印迹实验！

参考文献

1. Eaton SL, Roche SL, Llavero Hurtado M, Oldknow KJ, Farquharson C, Gillingwater TH, Wishart TM (2013) Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PLos One 8(8):e72457.
2. Janes KA (2015) An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Sci. Signal. 8(371): rs2. 
3. McDonough AA, Veiras LC, Minas JN, Ralph DL (2015) Considerations when quantitating protein abundance by immunoblot. Am J Physiol Cell Physiol. 308(6):C426-33. 
4. Ghosh R, Gilda JE, Gomes AV (2014) The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11(5):549-60. 
5. Gorr TA, Vogel J. (2015) Western blotting revisited: critical perusal of underappreciated technical issues. Proteomics Clin Appl. 9(3-4):396-405.