你是否曾想过:我设置的上样对照是否正确?


Ken B 发布于 2017 年 11 月 01 日 03:00:00

你正在收集你所有实验中的数据,并准备在年度进度报告时提交给你的顾问和论文委员会。你有一个有趣的假设,你还有一种经验证可在蛋白印迹实验 (WB) 中检测靶蛋白的抗体。该条带的分子量是正确的,并且靶蛋白的表达正如你预测的那样改变。现在,你知道 — 并且百分之百确定 — 当那张幻灯片出现时,委员会中的某个人将会问有关上样对照的问题。

无论是设置新一批的蛋白印迹实验,还是解释文献中的蛋白印迹数据,在比较蛋白印迹条带时都应该记住两个问题:1) 泳道是否等量上样?2) 信号是否处于检测的线性范围内?

为了补偿样品变化并确保等量上样,通常以 β-肌动蛋白或 GAPDH 等上样对照/“管家”蛋白的形式测定细胞蛋白含量(参见“我如何选择上样对照?”)。理论上,印迹上的管家蛋白数量与细胞数量成比例,但这可能是一个误导性的假设,特别是使用单个蛋白进行标准化时 (1)。尽管使用单个上样对照较为常见,但增加数量可确保更小的差异。最好考虑使用 5 个上样对照 (2, 3)。

遗憾的是,上样对照蛋白通常远比目的蛋白富集。当在单一稀释度下测定对照和靶蛋白时,更富集的蛋白的信号可能较为饱和,会超过检测线性动态范围。饱和对照条带不完全报告泳道之间的差异。你可能会理解这个问题如何能强化关于等量上样的假设,从而可能得出关于实验变量的虚假结论!

参见蛋白印迹实验失败的代价。

有时,过量上样和饱和会导致残缺印迹,而不是有序条带,或有“燃尽状”或“凹陷状”中心的条带,表明 HRP 偶联二抗已耗尽化学发光试剂的局部浓度。这可能伴随着膜上有褐色斑点,即过氧化物酶过度活化的一种副产物。以下显示的是这种现象的一个极端例子。 

ROI 021417 裂解活化的 Casp1(Asp296) (1)-1

你是否明白那种燃尽的感觉?

但请注意,你的印迹上不存在“怪异”条带或褐色斑点可能并不指示线性信号。即使对照条带看起来较为有序,但仍然可能是饱和的 (2)。为了证明上样对照和目的蛋白的线性,在同一印迹上上样一系列样品稀释液,或同时转移多个印迹以避免转移效率变化 (2, 3)。滴定蛋白输入,一抗和/或化学发光试剂可能是获得线性范围所必需的,特别是高表达的上样对照。在下面的例子中,需要更长和更短曝光才足以分别获得 HNF1 和 GAPDH 的线性信号。

HNF1A-GAPDH-10-+-83-sec_c.gif

使用经活化显示两种曝光的 HNF1α (D7Z2Q) 兔单克隆抗体 #89670(左图)或 GAPDH (D16H11) XP® 兔单克隆抗体 #5174(右图)对不同细胞系的提取物进行蛋白印迹分析。 

蛋白印迹信号也高度取决于检测方法。与胶片相比,使用电荷耦合器件 (CCD) 相机检测增强型化学发光 (ECL) 可产生出色的线性动态范围。如果数字信号饱和,则可以使用软件设置来显示红色像素。荧光扫描(使用与荧光染料而不是过氧化物酶偶联的二抗)经证实可避免发光化学的固有限制,因而更好。

在设置实验时,这些方法可能意味着更少的梯度稀释次数。但如果你的实验室无法使用最新最好的技术,你也可以使用传统 ECL 和胶片获得较好的数据,但需要你花时间设置实验,以解决等量上样和动态范围问题。

总而言之,使用多个上样对照显然是一个耗费时间和试剂的问题。一种愈加可行的替代方法是测定每个样品泳道中的总蛋白上样量,这是多对照概念的一种逻辑延伸,无需探测多个上样对照。测定总蛋白涉及对每个泳道 (1) 的蛋白条带或至少多个离散条带 (3) 进行染色和扫描。谨慎的做法是确认染色剂不会干扰后续的免疫检测(可能取决于抗体),或者进行二重印迹实验,一个针对总蛋白,另一个针对抗体。

对于许多研究生和博士后,可能会觉得进行蛋白印迹实验是“常规程序”。但重要的是,要记住,解释蛋白印迹实验的数据时(对任何实验都一样),细节决定成败。仔细考虑样品制备、转移条件和一抗等问题,将帮助你避免出现失误 (2, 4-5)。

到了发表的时候,记得提供所有详细信息,以便其他人准确评估结果并重复做实验。换言之,负责地进行印迹实验!

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 参考文献

  1. Eaton SL, Roche SL, Llavero Hurtado M, Oldknow KJ, Farquharson C, Gillingwater TH, Wishart TM (2013) Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PLos One 8(8):e72457.
  2. Janes KA (2015) An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Sci. Signal. 8(371): rs2. 
  3. McDonough AA, Veiras LC, Minas JN, Ralph DL (2015) Considerations when quantitating protein abundance by immunoblot. Am J Physiol Cell Physiol. 308(6):C426-33. 
  4. Ghosh R, Gilda JE, Gomes AV (2014) The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11(5):549-60. 
  5. Gorr TA, Vogel J. (2015) Western blotting revisited: critical perusal of underappreciated technical issues. Proteomics Clin Appl. 9(3-4):396-405. 

 

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

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