获得发表级免疫荧光图片的 5 个步骤


Tara W 发布于 2017 年 9 月 06 日 15:30:00

5_Steps_Pub_IF_Blog_header_1600x200.jpg

一张图胜过千言万语,或者对于免疫荧光成像来说,就是一张图胜过一千种蛋白。用于描述科学实验的图像所传达的信息量应不逊于文本。在 CST,我们的抗体质量和严格的验证流程让我们深感自豪。当我们批准将一抗用于免疫荧光实验时,我们会使用内部生成的高品质成像展示它们。除了我们建议的免疫荧光实验步骤之外(点击此处查看),本文还列出了在计划免疫荧光染色时要注意的一些其他考虑事项。 

第 1 步:细胞健康

你使用的细胞的健康状态会反映在你的免疫荧光图像中。周末被遗忘在孵育箱中的平板上的细胞可能会产生多核及应激颗粒,出现污染或死细胞碎片(见下文)。

免疫荧光支原体污染


第 2 步:融合度

有时,我们想要关注高度融合的细胞培养物的信号转导,比如使用 ZO-2(如 ZO-2 Antibody #2847)进行紧密连接染色。但如果细胞过度融合,又没有任何明确的边缘,在你的图像中便会看不到背景。另一方面,如果细胞过于稀疏,则待成像的视场选择就会受到限制。


第 3 步:一抗的选择

使用经严格验证的抗体可使成像流程更加顺利。如果在生成最终图像前已完成所有验证工作(滴定、实验步骤优化),即可获得最佳结果。高内涵分析软件所生成的灰度图像,对以平板模式比较抗体强度十分有用(左)。单色或双色图像足以用来确定最佳工作稀释度(中间)。这些早期分析可确保最终的三色图像最能再现目的靶标(右)。

RAIG1 (D4S7D) XP® Rabbit mAb #12968


第 4 步:二抗和复染剂

在 CST,我们通常使用 Alexa Fluor® 488 偶联二抗(或一种直接偶联 Alexa Fluor 488 的抗体)来检测目的靶标,因为它的绿色荧光非常醒目。此外,还应选择复染剂和 DNA 染料来帮助突显抗体染色并提供背景,但不应掩蔽目的靶标染色


步骤 5:视场和变焦

如果可能,选择可展示抗体性能且细胞数量适当(我们的目标是大于 3)的视场 - 如果染色的异质性较强,则要确保挑选一个能展示这种特征的视场。如果过度缩小,那么你可能无法表现具体的亚细胞定位(如有丝分裂或黏着斑)。


跟任何技术一样,熟能生巧。你掌握的荧光染色实验越多,操作就越自如,你获得的图像质量也会越好。即使是要查遍一个孔中的每个视场才能获得你想要的结果,也值得付出努力。祝你好运,愿你总能看到荧光团!

使用 Lamin A/C (4C11) Mouse mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #8617 对 HeLa 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。

有兴趣进一步了解一个好的免疫荧光实验方案如何帮助你推进研究?观看 CST 细胞术负责人探讨如何使用荧光成像和流式细胞术实验来优化细胞信号转导活动分析。

观看视频

 订阅以了解最新的博客帖子

实验室期望 - 实验室科学家需知的提示、诀窍和技术

Alexa Fluor 是 Life Technologies 公司的注册商标。
DRAQ5 是 Biostatus Limited 的注册商标。
MitoTracker是Molecular Probes, Inc的注册商标。 

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

订阅电子邮件

最新文章

Powered by Translations.com GlobalLink OneLink SoftwarePowered By OneLink